Yeni nesil genetik analiz yaklaşımları, çok sayıda genomik bölgenin aynı anda analizini sağlayarak klinik genetikteki tanı oranlarını büyük oranda arttırdı. Öyle ki, her 7 ayda dünya genelinde elde edilen genomik verinin miktarı ikiye katlanıyor. Kuşkusuz, bu veri artışı klinik yorumlama gerektirecek varyantların sayısını da artırıyor. Örneğin, bir hastanın ekzom dizilemesi sonucunda 40 bine yakın varyant tespit edilebiliyor. Yüksek hacimli bu verilerin değerlendirilmesi, günümüzde klinik yorumlama süreçlerinde önemli dar boğazlardan da biri. Bu sebeple, her geçen gün varyant patojenitesinin daha hızlı ve doğru olarak değerlendirilmesi ihtiyacı da artıyor.
Günümüzde, varyantların hastalık üzerindeki etkisinin belirlenmesinde her bir kurumun kendine ait yaklaşımları bulunuyor. ACMG/AMP gibi kurumların yayınladığı kılavuzlar, varyant değerlendirme süreçlerini her ne kadar kısmen kolaylaştırsa da, kurumların bu kılavuz kriterlerine yaklaşımları hala subjektif olabiliyor. Bu nedenle, aynı varyantlar çoğu zaman farklı kurumlarca farklı şekilde yorumlanıyor.
Aynı Kılavuz Farklı Yorum
Kurumlar arası farklılığın ölçülmesine yönelik 2016 yılında yürütülen bir çalışmada, 9 farklı tanı laboratuvarı seçilmiş ve aynı varyantları değerlendirmeleri istendi [Amendola et al., 2016]. Bu karşılaştırma neticesinde önemli 2 sonuç çıktı:
- Farklı kurumlar tarafından yapılan patojenite yorumları %66 oranında farklılık göstermektedir.
- Farklı yorumlanan bu varyantların %22’si, hastalığın teşhisi ve tedavisinde kritik öneme sahiptir.
Diğer bir deyişle, kılavuz kullanımında dahi, kurumların salt kendi yaklaşımlarını kullanması, tanı oranlarının düşmesine veya yanlış tanı verme ihtimallerinin artmasına neden olabilmektedir. Aynı çalışmanın, bir diğer önemli çıktısına göre:
- Farklı kurumların kendi aralarında konsensus oluşturduğu durumlarda, varyant raporlamadaki farklılıklar %66’ten %27’e düşmektedir. Farklı raporlanan kritik varyantların oranı ise %22’den %3’e düşürmektedir.
Diğer bir deyişle, farklı kurumların ve analistler arasında kurulacak diyalog, tanı koyma oranını büyük oranda arttırmaktadır.
Gen Era Klinik Biyoinformatik Ekibi
Gen Era olarak klinik genetikte bu diyalog ve konsensus ortamını oluşturmayı hedefliyoruz. Bu amaçla, 6 kişilik tecrübeli genom analist ekibimiz ile her bir genetik testi, literatür, hesaplamalı uygulamalar ve kılavuzlara dayalı olarak değerlendiriyoruz ve hizmet verdiğimiz kurumlar ile paylaşıyoruz.
Gerçekleştirdiğimiz her bir klinik biyonformatik analiz sürecinde;
- Hastalara ait klinik bulgulara yönelik literatür taraması gerçekleştiriliyor.
- Elde edilen genomik veriler kalite açısından değerlendiriliyor.
- Yüksek hacimli genomik veri, hastanın bulgularına uygun şekilde filtreleniyor.
- Kalan varyantlar, birden fazla genom analistinin değerlendirilmesine sunuluyor.
- Her bir genom analisti, filtrelenen varyantları tüm ACMG kriterlerine göre değerlendiriyor.
- Analistler varyant patojenitesine yönelik konsensus oluşturduklarında, özet yazılıyor.
- Raporda yer alan varyantlar Sanger veya MLPA ile teyit ediliyor ve
- Tüm değerlendirme sonuçları, kanıtları ile birlikte raporlandırılarak Analiz Özeti oluşturuluyor.
Tüm bu detaylı süreçlerin yönetilmesi, desteklenmesi ve standardizasyonunda, 2018 yılında geliştirmeye başladığımız GenerAVI otomatik patojenite yorumlama aracını kullanıyoruz.
GenerAVI : Varyant Yorumlamada Konsensus
GenerAVI, klinik varyant yorumlamada konsensus oluşturmayı sağlayan kapsamlı bir platform. Bu platform, farklı analistlerin varyantlara yönelik değerlendirmelerini ve bunlara dair sunulan kanıtları tek bir havuzda birleştirmeyi sağlıyor. Genom analistlerimiz tarafından hastada bulunan bir varyanta yönelik ACMG kriter değerlendirmeleri, kanıtları ile birlikte sisteme kaydediliyor. İleri bir dönemde, aynı varyant benzer bir hastada tespit edildiğinde önceki değerlendirmeler analistlere sunuluyor. Her bir değerlendirme, güncelliği sağlamak amacıyla 6 ayda bir tekrarlanıyor. Bu şekilde, GenerAVI bünyesinde hastalık-varyant ilişkilerine yönelik büyük ve güncel bir veritabanı yapısı sağlayabiliyoruz.
GenerAVI sadece bir veritabanı değil, aynı zamanda ACMG kriterlerini temel alan otomatik sınıflandırma yapabilen bir patojenite yorumlama aracı. Mevcut versiyonda ACMG’nin 12 farklı kriteri sistem tarafından otomatik olarak hesaplanarak değerlendirilebiliyor. Desteklenen kriterleri her ay iyileştirerek, yenilerini ekliyoruz. Sistem, ClinVar ve Expert Panel içeriklerine göre haftalık güncellemeler sağlayarak en güncel verilerin kullanılmasını sağlıyor.
Otomatik kriterler: PVS1, PVS1-M, PS1 (Yakında), PM1 (Yakında), PM2, PM4, PM5 (Yakında), PP2, PP3, PP5, BA1, BS1, BP1, BP4, BP6, BP7 (Yakında)
Otomatik değerlendirilen ACMG kriterlerinden birkaçı için yaklaşımızdan bahsetmek gerekirse:
PVS1: Bu kanıt, LOF (loss-of-function) mekanizması ile hastalıkta etkili genlerdeki LOF değişimlerin değerlendirilmesinde kullanılıyor. GenerAVI’de, bu mekanizmaya sahip genlerin tespiti için ClinVar üzerinde en az 1 adet patojenik LOF mutasyonuna sahip olan genleri temel liste olarak alıyoruz. Bu genlerde canonical transkriptin sondan bir önceki ekzon sınırından 50 baz öncesinde yer alan ve LOF (frameshift,nonsense,splice) özellikteki varyant PVS1 kanıtını alıyor. Son ekzon ve öncesindeki kodlayan 50 bazda olabilecek LOF değişimleri, non-mediated-decay yolağını tetiklemeyeceği için bu kanıt kapsamına alınmıyor.
PVS1-M: ACMG’ye göre PVS1’in özelliklerine (LOF etkili gende LOF özelliğine) sahip varyantlar, son ekzonda yer almaları durumunda PVS1 kanıtını alamıyor. Bu varyantların patojenitelerini de dikkate almak amacıyla, Gen Era olarakPVS1-M adıyla ara kriter oluşturduk. Buna göre, LOF özellikte bir varyant, son ekzonda ve öncesindeki kodlayan 50 baz içinde yer alıyorsa PVS1-M olarak değerlendiriliyor ve bir PM kriteri olarak sayılıyor. Aynı kriteri, ekzon-intron sınırının yakınsağındaki bölgelerde (±3 ve ±10) yer alan varyantlar da alıyor.
PM4: Tekrar bölgelerinde yer almayan inframe indellerin değerlendirildiği bu kanıt, GenerAVI tarafından otomatik değerlendiriliyor. Genomdaki bilinen tekrar bölge verilerini UCSC’in repeatmasker veriseti ile çıkarıp bu bölgelerin dışında yer alan ve çerçeve kaymasına neden olmayan indel değişimlere PM4 kanıtını veriyoruz.
PP2-BP1: Clinvar veritabanı üzerinden, “bir gen üzerindeki patojenik varyantların %80’inden fazlası missense ise (en az bir) ve gen üzerindeki missense varyantların %10’undan azı benign ise” koşulu ile gen listesi oluşturduk. BP1 için: “bir gen üzerindeki patojenik varyantların %80’inden fazlası stop-gain, stop-loss, frameshift indel, splice site varyantlar ise” koşuluyla gen listesi oluşturuldu. Bu genlerde yer alan missense değişimler ise bulunduğu gen listesine göre PP2 veya BP1 alıyor.
PP3-BP4-BP7: In silico patojenite hesaplama algoritmalarının çıktılarının değerlendirildiği bu kanıtta, birden fazla aracın sonuçlarını beraber inceliyoruz. Bu kapsamda, SIFT, Mutationtaster, PolyPhen, GERP, PyloP, MetaLR, MetaSVM, LRT ve MCAP gibi algoritmaları kullanıyoruz. Hesaplama yapabilen araçlardan en az 5’i patojenik sonuca sahip ise PP3, benign sonuca sahip ise BP4 alıyor. Ekzon-intron kırpılma bölgelerinde ise MaxEntScan algoritması kullanılıyor.
GenerAVI, tüm bu değerlendirme sonuçlarını anlaşılır ve detaylı bir rapor formatında klinisyenlere sunuyor. Rapor içeriğinde ACMG kriterlerine göre patojenik, muhtemel patojenik ve VUS özellikteki varyantlar ayrı tablolarda belirtiliyor. Bu tablolarda, varyanta ait pozisyon, transkript ve varyant fraksiyonu gibi bilgilerin yanı sıra ACMG tabanlı patojenite değerlendirmeleri de yer alıyor. Bu kısımlarda, varyantın sahip olduğu ACMG kriterlerinin kodları, açıklamaları ve ilgili kriterleri almasını sağlayacak kanıtlar (yayınlar, parametreler ve frekans değerleri) detaylı olarak açıklanıyor.
Referanslar:
- Amendola LM, Jarvik GP, Leo MC, et al. Performance of ACMG-AMP Variant-Interpretation Guidelines among Nine Laboratories in the Clinical Sequencing Exploratory Research Consortium. Am J Hum Genet. 2016;98(6):1067-1076.